Для перевірки праймерів зрівняний пул зразків з кожної біологічної групи розбавляють 1:20 і спочатку тестують за допомогою термічного градієнта, щоб визначити оптимальну температуру відпалу, середній рівень експресії та унікальний продукт для кожної мішені на основі кривої плавлення та аналізу гелю.

Виберіть набір праймерів з мінімальним утворенням вторинної структури. Після цього можна використовуйте Primer BLAST для праймерів, отриманих за допомогою олігоаналізатора IDT. Якщо результат вибуху показує генетичну послідовність бажаного гена, розроблені праймери ідеальні.

PCR Primer Design Поради

1. Прагніть до того, щоб вміст GC був між 40 і 60%, а 3' праймера закінчується на G або C для сприяння зв’язуванню. …
2. Хороша довжина праймерів ПЛР зазвичай становить близько 18-30 основ. …
3. Спробуйте зробити температуру плавлення (Tm) праймерів між 65°C і 75°C і в межах 5°C одна від одної.

Розрахуйте ефективність праймера, використовуючи значення нахилу Це дасть вам оцінку ефективності праймера у відсотках. Сподіваємось, це 90-110%. Використовуючи наведений вище набір даних, ефективність досягає 98%. Якщо ваша стандартна крива та ефективність праймера не в межах бажаного діапазону, не хвилюйтеся.

Етап клінічної валідації

1. (1) Порівняння методів дослідження, де розділені зразки тестуються паралельно з відповідним методом золотого стандарту.
2. (2) Дослідження відновлення, де перевірені зразки або інші перевірені типи зразків порівнюються з аналізом, що розробляється.

Для перевірки праймерів зрівняний пул зразків з кожної біологічної групи розбавляють 1:20 і спочатку тестують за допомогою термічного градієнта, щоб визначити оптимальну температуру відпалу, середній рівень експресії та унікальний продукт для кожної мішені на основі кривої плавлення та аналізу гелю.